Since chitosan is biocompatible and biodegradable, it has been studied as a good material as a gene delivery carrier. In this study, we have developed and studied a gene delivery carrier by introducing methyl acrylate and polyethylenimine using glycol chitosan, a derivative of chitosan. GMP1300 and GMP2000 were identified by 1H NMR and electrophoresis was performed to confirm the binding ability with pDNA. The particle size and surface charge of GMP1300 and GMP2000 with pDNA were measured using a zetasizer. Cytotoxicity was assessed using HeLa and HEK293 cell lines, and cellular uptake was confirmed by confocal microscopy. In addition, the gene expression rate in HeLa cell line was confirmed by confocal image through green fluorescent protein (GFP), and transfection efficiency was measured by protein quantification. As a result, the prepared nanoparticles were expected to be used as biocompatible gene delivery carriers because of their low toxicity and strong binding force with genes.

최근 많은 연구를 통해 유전자 전달체로써 생체 적합하며 생분해성이 뛰어난 키토산에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 키토산의 유도체인 글리콜 키토산을 사용하여 메틸 아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 도입하여 유전자 전달체를 개발 및 연구하였다. 최종 합성물인 GMP 1300과 GMP 2000은 핵자기 공명 분광기를 이용해 합성 정도를 평가하였고, 플라스미드 DNA와의 결합력 확인을 위해 전기영동을 수행하였다. 그리고 나노입자 분석기를 이용하여 플라스미드 DNA와 결합시킨 GMP 1300과 GMP 2000의 입자 크기와 표면 전하를 측정하였다. In vitro 실험을 위하여, HeLa와 HEK 293 세포주를 이용하여 세포 독성 평가를 진행하였고, 세포 유입은 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 또한 유전자 발현율을 평가하기 위해 녹색 형광 단백질을 발현하여 이미지로 확인하였고, 루시페라아제와 단백질 정량을 통해 유전자 발현 효율을 측정하였다. 그 결과, 본 연구에서 제조된 나노 입자들은 독성이 현저히 낮으며, 유전자와의 결합력이 강하고, 세포 내 유입에 용이하다는 것을 통해 생체적합한 유전자 전달체로써 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Keywords: gene delivery, cationic polymer, glycol chitosan, polyethylenimine, transfection

최근 유전적인 질병뿐만 아니라 암을 비롯한 다양한 질병을 치료하기 위하여 유전자를 이용한 유전자 치료법이 연구되고 있다. 질병을 치료하기 위해서 사용되는 유전자 치료법에는 바이러스성 또는 비 바이러스성 전달체로 나눌 수 있다. 바이러스성 전달체는 유전자 전달 효율은 매우 높지만 면역 반응을 일으키며 부작용이 심하다는 단점을 가지고 있어 근래에는 비 바이러스성 전달체를 개발하여 많은 질병 치료를 위한 연구가 이루어지고 있다. 비 바이러스성 전달체는 연구자가 직접 물질을 선택하여 개발할 수 있으며, 바이러스성 전달체에 비해 면역 반응이 적다는 장점을 지니고 있지만 유전자 전달 효율이 바이러스성 전달체에 비해 낮다는 단점이 있다.^1-3 이러한 문제를 보완하기 위하여 리포좀, 마이셀 뿐만 아니라 양이온성 고분자를 이용하여 많은 유전자 전달체가 개발되고 있다. 이 때, 많이 사용되는 양이온성 고분자는 폴리라이신(poly L-lysine), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI), 키토산(chitosan), 그리고 폴리아미도아민(polyamidoamine) 등이 있다. 이와 같은 양이온성 고분자는 높은 농도로 사용하였을 때 독성이 나타날 수 있기 때문에 표면을 개질하여 독성을 줄이며 유전자 전달 효율을 높이기 위한 연구가 이루어지고 있다.^4-6
특히, 양이온성 고분자 중 키토산은 갑각류로부터 추출한 천연고분자 물질인 키틴으로부터 제조되어 다양한 유도체로 사용되고 있다. 키토산과 그 유도체들은 생체적합성을 가지며 생분해성이 뛰어나 체내에서 독성이 없고 면역 반응을 일으키지 않는다는 장점이 있다. 또한 양전하를 가지기 때문에 여러 종류의 핵산과 효율적으로 복합체를 형성할 수 있어 질병을 치료하기 위한 전달체뿐만 아니라 다양한 분야에서 생체 재료로써 개발되고 있다.⁷ 그러나 키토산 자체로는 물에 잘 녹지 않고 산을 포함한 수용액에만 용해되는데 반해 키토산의 유도체인 글리콜 키토산의 경우 수용성 키토산으로써 물에 용해가 잘 된다는 특징을 가지고 있다. 이러한 특징을 가지는 글리콜 키토산은 유전자 전달체를 비롯하여 약물 전달체로도 많이 연구되고 있으며 나노 입자, 마이셀, 그리고 하이드로젤의 형태로 응용되고 있다.^8,9
또한 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)은 다양한 분자량을 가지며 선형과 가지형으로 존재하며 구조에 많은 아민기를 포함하고 있다는 특징이 있다. 많은 아민기는 양이온성을 나타내게되고 음이온성을 띠는 유전자와 결합이 쉽다. 유전자 자체로는 음이온성을 띠는 세포막을 투과하기 어려우며 양이온성 고분자와 복합체를 형성하여 전달하였을 때 높은 전달력을 통해 단백질 효율이 높아지게 된다.^10-13 그러나 높은 분자량을 가지는 PEI는 많은 수의 아민기로 인해 세포에 영향을 주어 독성을 나타낼 수 있기 때문에 적절한 분자량의 PEI를 사용하는 것이 매우 중요하다.
본 연구에서는 키토산의 유도체인 글리콜 키토산(GC)을 기반으로 하는 고분자를 제조하였다. 양이온성을 높이기 위하여 PEI를 도입하였으며 GC와 PEI 중간에 메틸 아크릴레이트(MA)를 연결하여 주었다. MA는 덴드리머를 제조할 때 많이 사용되는 물질로써 마이클 첨가(Michael addition) 과정을 통해 아민기와 반응하여 긴 사슬의 아민기를 도입할 수 있게된다.¹⁴ 이와 같이 GC에 MA를 연결한 후 도입된 PEI는 두종류의 분자량(1300, 2000 Da)을 사용하여 고분자를 개발하였다. 제조된 고분자는 비 바이러스성 전달체로써 활용을 위하여 유전자와 결합력을 확인하였으며, 복합체를 형성하였을때 가지는 크기와 전하를 확인하였다. 또한 동물 세포에 대한 농도별 독성 평가를 수행하였으며, 세포 내 유입을 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 최종적으로 유전자 전달 효율을 확인하기 위하여 녹색 형광 단백질을 발현할 수 있는 유전자와 복합체를 형성하여 세포 내로 전달하였을 때 녹색 형광 단백질이 발현된 정도를 공초점 현미경 이미지를 통해 확인하였고, 루시페린과 만나 발광할 수 있는 단백질을 발현시킬 수 있는 유전자를 통해 유전자 전달 효율을 평가하였다. 이와 같은 특성 및 in vitro상 실험을 통하여 생체 적합한 유전자 전달체로써 가능성을 알아보고자 하였다.